Identificación molecular de especies

Se determina la especie de organismos por medio del técnicas moleculares como el código de barras de la vida. La identificación molecular sirve para determinar la especie de cualquier organismo de nuestro interés, ya sea animal, planta, hongo o bacteria.

Solicitud de Servicio

La persona, organización, institución gubernamental o empresa privada interesada en que se le haga un estudio de identificación molecular de especie en el LBM deberá hacer una solicitud a la dirección del instituto o directamente con la responsable del servicio. En dicho contacto, el cliente deberá especificar el grupo biológico al que pertenece su muestra. 

Entrega y manipulación de las muestras

Las muestras se entregarán en el LBM sede Pabellón Nacional de Biodiversidad IB sin ninguna excepción, bajo las indicaciones que serán enviadas al usuario del servicio vía correo electrónico. No se tiene facultad para hacer muestreos dentro o fuera de las instalaciones del IB. La manera de entregar las muestras y el método de preservación dependerá del grupo biológico al que pertenezca y a la naturaleza de las mismas.

Extracción de DNA genómico

Los métodos de extracción a utilizar dependerán de la naturaleza de la muestra. En principio, en el LBM se utilizan tres métodos diferentes para la extracción de tejido animal: Método de extracción con Kit comercial de columnas de intercambio iónico para animales, Extracción por kit de precipitación con sales y Extracciónes en crudo. En el caso de plantas se puede utilizar el Método de extracción con kit comercial de columnas de intercambio iónico o el Método 2X CTAB, dependiendo de la naturaleza de la muestra. Finalmente, para hongos y bacterias, se utilizará el método de extracción con kit comercial de precipitación con sales para hongos y el método de extracción con kit comercial de precipitación con sales para bacterias, respectivamente. En muestras provenientes de cultivo sólido, se utilizará el método de PCR de colonia. 

Electroforesis 

Para evaluar la calidad de la extracción se efectúa una electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE. Para determinar el tamaño del amplicón, después de la PCR, se usa un marcador molecular en escalera de 100pb, 1kb o 1kb Plus, según sea conveniente. 

Cuantificación de DNA

El DNA genómico extraído se cuantifica por medio del espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) a una longitud de onda de 260nm. El aparato realiza otras dos mediciones para determinar la pureza del DNA con respecto a proteínas (280nm) y a carbohidratos y otras moléculas (230nm). 

Preparación de la Reacción de PCR

El marcador genético elegido para la identificación molecular dependerá del grupo biológico al que pertenezca la muestra. Así, para animales se utilizará un fragmento del gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI), para plantas se utilizarán tres regiones de DNA de cloroplasto, los genes matK y rbcL, y el espaciador intergénico trnH-psbA, para hongos se utilizará el espaciador transcrito interno (ITS) y la subunidad grande ribosomal (LSU) del núcleo, y para bacterias el gen ribosomal 16S.

Secuenciación de los Productos de PCR

Todos los productos de la “PCR” positivos son secuenciados por secuenciación capilar Sager en ambas direcciones (“F” y “R”). 

Ensamblado y Análisis de las secuencias.

Los resultados obtenidos de la secuenciación, son ensamblados para generar las secuencias de consenso, con el paquete de programas de cómputo Geneious versión 10.1.3 

Asignación taxonómica (identificación)

Para la asignación al grupo taxonómico correspondiente de la o las secuencias, cada secuencia consenso ensamblada, es evaluada bajo dos criterios de acuerdo a los resultados obtenidos de la comparación con las secuencias depositadas en GenBank mediante la opción BLAST del programa Geneious, especificando que la búsqueda utilice los parámetros básicos y la selección de las 50 secuencias más similares a la secuencia incógnita.

Entrega del reporte final

El informe de resultados se entrega dentro de los 15 días hábiles posteriores a la entrega de las muestras. En dicho documento se indica con claridad las condiciones de la muestra o muestras a identificar, la fecha de recepción, así como la metodología para la extracción y amplificación del DNA, ensamble de las secuencias de consenso, análisis de las secuencias, la asignación taxonómica por marcador, resultados globales, consideraciones finales y conclusiones.