Descripción de la técnica

Manejo y digestión de muestras complejas o simples de proteínas en gel, solución, membrana e inmunoprecipitados, purificación y concentración de las mismas para su identificación. Las proteínas de interés en un experimento de proteómica pueden ser analizadas directamente mediante espectrometría de masas.

El punto de partida puede ser diferente. Si partimos de proteínas separadas mediante 1D o 2D PAGE, el primer paso del análisis consistiría en recortarlas directamente del gel dónde han sido resueltas (“picado” de spots). Este proceso de recorte se lleva a cabo manualmente por el usuario en sus laboratorios, pidiendo a los mismos que extremen la limpieza y que además envíen “spots” control (proteínas conocidas, por ejemplo marcadores de peso molecular).

Si partimos de muestras líquidas (fracciones de una cromatografía o un extracto protéico que contenga mezcla de proteínas, un inmunoprecipitado etc) comenzaríamos llevando a cabo una concentración y limpieza de la muestra, seguida de la desnaturalización, reducción y alquilación de la misma.

En ambos casos (proteínas separadas en gel o proteínas en solución), el siguiente paso en el procedimiento sería la digestión de las mismas mediante una proteasa específica (generalmente tripsina porcina) también efectuamos digestiones múltiples con quimotripsina y Lys-C, que genera un conjunto de péptidos que pasan a ser analizados por espectrometría de masas.

Mediante espectrometría de masas es posible obtener información estructural de las proteínas tal como secuencia de aminoácidos y la masa de los péptidos. Esta información puede utilizarse para identificar proteínas comparando los resultados con bases de datos.

Características del equipo

• Espectrómetro de Masas modelo Synapt G2S, con tiempo de Vuelo acoplado a un Cromatógrafo de Líquidos Modelo nanoACQUITY, ambos marca WATERS.
• Nanodrop 2000 Thermo Scientific
• Equipo auxiliar:
  Ultracongeladores -20°C y –80°C,
  Speed Vac,
  Baño seco digital
  Centrifugas
  
  

Áreas de aplicación

Alimentos: Proteómica de alimentos

Medicina: Identificación y/o seguimiento de marcadores moleculares de una enfermedad o padecimiento

Industria Farmacéutica: Caracterización Fisicoquímica de Biofármacos

Agricultura: Estudios de proteómica para la determinación de marcadores moleculares relacionados a productividad, mejoramiento de semillas y nuevas líneas a introducir, resistencia a plagas entre muchos otros.

Especificaciones de la muestra


Identificación en gel:

Las muestras deberán ser escindidas de un gel de poliacrilamida previamente teñido con azul de coomassie coloidal y colocadas en un tubo eppendorf de 1.5 ml que debera estar bien identificado, la clave de la muestra debe ser legible y con un máximo de 10 caracteres.

Identificación en solución:

Las muestras de proteínas en solución deberán ser enviadas en tubos eppendorf de 0.5 ml, deberá contener al menos 500ng (200ng/ul), el tubo deberá estar correctamente rotulado con la clave de la muestra y está debe ser legible y con un máximo de 10 caracteres.

Identificación en membrana:

Las muestras deberán ser cortadas de la membrana de nitrocelulosa y colocadas en tubos eppendorf de 1.5 ml el cual deberá estar correctamente rotulado con la clave de la muestra y esta debe ser legible y con un máximo de 10 caracteres.

Consideraciones para muestras preparadas de inmunoprecipitaciones para análisis por espectrometría de masas

Existen una gran cantidad de formas de preparar muestras de IPs para espectrometría de masas. Aquí se describen algunas consideraciones y problemas que se pueden encontrar que uno puede enfrentar en este campo.

La abundancia del blanco y la afinidad del anticuerpo pueden ampliamente determinar el éxito del aislamiento de los complejos protéicos en la inmunoprecipitación.

Complejos protéicos unidos a membranas son especialmente difíciles debido a su baja abundancia en comparación con las proteínas solubles. Un punto muy importante para cualquier IP son las condiciones de lisis y las condiciones de inmunoprecipitación se recomienda una entrevista previa con el personal de la unidad para revisar las consideraciones y optimización para una IP compatible con el análisis de espectrometría de masas..