Descripción de la técnica

La prueba se basa en la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR por sus siglas en ingles) donde un fragmento de ADN conocido es copiado y amplificado billones de veces. El producto del PCR (punto final) es posteriormente visualizado en un gel de agarosa y proporciona evidencia cualitativa de la presencia de ese fragmento de ADN en la muestra.

La PCR en tiempo real es una modalidad del PCR de punto final, donde la acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir: “En tiempo real” esto se logra incorporando una molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado, donde el incremento de esta fluorescencia es la proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.

La PCR en tiempo real utiliza termocicladores equipados con módulos de diodos de luz (LED´s) para detectar la fluorescencia acumulada en la reacción al término de cada ciclo. Los protocolos de la PCR en tiempo real pueden diseñarse para obtener resultados cuantitativos así como demostrar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN o ARN o resultados cuantitativos calculando el número de copias de ADN, que al compararse con una curva estándar, establece la cantidad de microorganismos presentes en una muestra determinada o bien determinar el número de moléculas de un ARN para designar la expresión de este por ejemplo.

La gran ventaja de esta técnica es la flexibilidad en su diseño operativo ya que permite la detección cualitativa o cuantitativa del ácido nucleico dependiendo del propósito por lo cual la prueba es solicitada.

Características del equipo

La unidad cuenta con 3 equipos para la cuantificación de ácidos nucleicos:

• • Applied Biosystems 7500 real time cuenta con un formato de cambios térmicos cíclicos de alta velocidad con una plataforma de 96 pozos que entrega resultados de alta calidad en menos de 30 minutos.

Ofrece análisis robustos de alta resolución en estudios de fusión.

• SFX96 real time system Biorad con las mismas características que el anterior, además de realizar análisis de HRM.
• Sistema de PCR Digital QX200 Biorad novedosa tecnología que permite el análisis de Expresión génica, Cuantificación absoluta, Genome edit detection, Número de copias por µl y es Ideal para baja concentración de templado.

Áreas de aplicación

• Análisis de expresión génica
• Diagnóstico de enfermedades infecciosas
• Procedimientos de clonación de ADN
• Identificación de mutantes y control de calidad en tecnología de ADN recombinante.

En la industria

• Estudios de diagnóstico
• Detección de organismos transgénicos
• Detección de OGM
• Cuantificación y genotipado en clínica
• Descriminación alélica
• Cuantificación de carga microbiana en alimentos o en material vegetal
• Identificación de fitopatógenos
• Ciencias forenses

Especificaciones de la muestra

Para RNA:

Para una muestra con calidad óptima para análisis en tiempo real considerar tres parámetros básicos:

• Pureza: Libre de impurezas orgánicas e inorgánicas (p.ej. fenol, cloroformo), y proteínas. Normalmente el grado de pureza se indica por una relación de absorbancia A260/280 y A260/230 igual a 1,8. Sin embargo, es recomendable utilizar un sistema de purificación, limpieza y concentración de RNA por columna (p.ej. RNeasy de Invitrogen).
• Integridad:
  a)Relación entre las bandas de rRNA 28S y 18S que se observan en un gel de agarosa como bandas discretas y cuya relación 28S/18S en un RNA íntegro es cercano a dos. Se recomienda una relación 28S/18S = 1,2.
  b)RIN: RNA Integrity Number, es un número que aplica el algoritmo del software del Bioanalizador 2100 Bioanalyzer de Agilent Technologies y que es un indicador del grado de degradación de la muestra de RNA. Un RNA intacto tiene un RIN 9-10, mientras que un RNA degradado tendría un RIN <6. Para las aplicaciones de PCR en tiempo real se recomienda un RIN mínimo de 7.
• Libre de DNA genómico: La técnica de análisis de expresión génica mediante PCR en tiempo real es extremadamente sensible a la contaminación de DNA genómico de la muestra de RNA, la cual puede afectar de forma significativa la sensibilidad y especificidad del resultado. El mejor método para evitar la contaminación de DNA genómico es utilizar un método de extracción que combine al extracción orgánica en fenol (Trizol Reagent) y la posterior purificación en columna. Existen kits de purificación en columna que incluyen un pretratamiento en columna con DNasa y posterior elución del RNA. En aquellos casos en los que la muestra contenta un grado de contaminación inaceptable para la aplicación de PCR a tiempo Real con SYBR Green (especialmente importante) debe tratarse la muestra con DNasa (QIAGEN o AMBION) y repurificar en columna tras el tratamiento. Es muy importante eliminar totalmente la DNasa ya que inactiva la reacción de retrotranscripción requerida en la síntesis de cDNA.
• Es esencial que las todas las muestras del análisis tengan grados de pureza (A260/280) e integridad (28S/18S y/o número RIN) comparables.
• Es necesario utilizar oligonucleótidos diseñados específicamente para PCR en tiempo real, ya que los amplicones no deben ser mayores de 200 kb, de preferencia entre 70 y 140 pb y se debe evitar la formación de dímeros entre estos para el análisis mediante SYBR Green. Existen diversos software disponibles para este diseño (p.ej. Beacon designer).
• La unidad ha validado con éxito el kit SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR con ROX de Invitrogen # de catalogo 11746-100. Este sistema combina la síntesis de cDNA y la reacción de Taq polimerasa en un solo paso con gran eficiencia por se recomienda su uso.
• Si se desea realizar el análisis en dos pasos, se recomienda el uso del Kit ImProm-II Reverse Transcriptase (Promega) para la síntesis de cDNA ya probado en nuestra unidad con resultados satisfactorios y el kit ExpressSYBR GReenER (Invitrogen).
• Se cuenta con la asesoría para el diseño de sondas y primers adecuados para ensayos de qPCR.
• Implementamos procedimientos para el procesamiento de datos obtenidos de cuantificación relativa en tiempo real. Este procedimiento para el procesamiento de datos obtenidos de cuantificación relativa en tiempo real. Dicho procedimiento evita completamente evaluación de la eficiencia de PCR , minimiza la participación del usuario y proporciona una evaluación estadística de la variación intra-ensayo .
• El procedimiento incluye los siguientes pasos . (I ) El ruido se filtra de las lecturas de fluorescencia primas suavizando , resta la línea de base y la normalización de amplitud . (II) El umbral óptimo se selecciona automáticamente a partir de los parámetros de regresión de la curva estándar. ( III ) Los puntos de cruce (CP) se derivan directamente de las coordenadas de los puntos donde la línea cruza el umbral de fluorescencia parcelas obtenidas tras el filtrado de ruido . ( IV ) Los medios y sus variaciones se calculan para los CPs en réplicas de PCR . (V ) Los resultados finales se derivan de los medios de CPS . Las variaciones de CPS se remontan a los resultados de la ley de propagación de errores .Se proporciona una descripción detallada y el análisis de este proceso de datos . Las limitaciones asociadas con el uso de métodos estadísticos paramétricos y normalización de amplitud se analizan específicamente y se encontró en condiciones de la práctica de laboratorio de rutina . Diferentes opciones se discuten para la agregación de los datos obtenidos a partir de múltiples genes de referencia .
• El procedimiento basado en la utilización de la curva estándar para el procesamiento de datos de la PCR ha sido compilado y validado . demuestra que el diseño de curva estándar sigue siendo una alternativa fiable y simple de los cálculos de eficiencia de PCR basados en PCR en tiempo real relativa.